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貨號(hào): YJS2421                                                   規(guī)格：50管/48樣

組織總磷含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

磷的存在形態(tài)包括無(wú)機(jī)磷與有機(jī)磷。無(wú)機(jī)磷主要指磷酸根，參與生物體內(nèi)多種代謝，包括能量代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)磷酸化和脫磷酸化等。通過(guò)測(cè)定總磷與無(wú)機(jī)磷含量即可了解作物對(duì)磷的利用率，進(jìn)而為合理施肥提供依據(jù)。

測(cè)定原理：

總磷經(jīng)消化后，轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)磷。鉬藍(lán)法是測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量的經(jīng)典方法，一定條件下，鉬藍(lán)與磷酸根生成660nm有特征吸收峰的物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定660nm光吸收，即可計(jì)算無(wú)機(jī)磷含量，進(jìn)而可計(jì)算出組織中總磷含量。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1ml玻璃比色皿、蒸餾水和濃硫酸。

試劑組成和配置：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存） （強(qiáng)腐蝕性，強(qiáng)氧化性）。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前配制，加入15mL蒸餾水，溶解后再加入10mL

試劑二，混勻。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 支，20μmol/L 無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液，－20℃保存。

有機(jī)磷消化：

取帶蓋試管，進(jìn)入精確稱取的約0.1 g組織，加濃硫酸1.0 mL，蓋緊（防止水分散失）后沸水浴10min左右，待溶液呈黑色或棕色時(shí)取出。稍冷后，加試劑一200μL，充分混勻，蓋緊后繼續(xù)沸水浴，直到溶液呈透明狀，取出室溫冷卻后，加蒸餾水8.8mL，充分混勻；室溫，8000g，離心10min，取上清液待測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 打開(kāi)水浴鍋，調(diào)節(jié)溫度到40℃。

3. 空白管：取EP管，依次加入500μL蒸餾水，500μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10min后于660nm測(cè)定吸光度，記為A空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，依次加入50μL標(biāo)準(zhǔn)液，450μL蒸餾水，500μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10min后于660nm測(cè)定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

5. 測(cè)定管：取EP 管，依次加入50μL上清液，450μL 蒸餾水，500μL試劑三，混勻后置于40℃水浴保溫10min，室溫冷卻10min 后于660nm測(cè)定吸光度，記為A測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

組織總磷含量計(jì)算公式：

（1） 按照蛋白含量計(jì)算

總磷含量(mmol/mg prot) = [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總÷Cpr= 1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

總磷含量(mmol/g )= [C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×V 總÷W= 1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)液：1 mmol/L；V 總：上清液總體積，10 mL=0.01 L；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；

W：樣品質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

1. 試劑三需臨用前配制，并且當(dāng)天使用完畢。

2. 40min內(nèi)完成比色。

3. 最DI檢出限為10μmol/L。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：